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本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光染料法的原理来进行miRNA荧光定量PCR检测。本产品是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂。2×miRNA qPCR Mix包含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR增强剂等所有PCR所需要的成分。miRNA qPCR Mix中所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。其中的Taq DNA polymerase是经化学修饰的高效热启动酶，配合独特的缓冲体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内对miRNA进行准确定量。

• 简便、快捷完成miRNA的检测。
  
• 检测通量高，只需最少的RNA样本，即可同时进行多种目标miRNA的检测。
  
• 检测特异性好，独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染。
  
• 检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA。
  
• 检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA。

成分	规格
2×miRNA qPCR Mix	0.75mL
Reverse Primer(10μm)	30μL
RNase-Free Water	1mL
miRNA cDNA第一链合成试剂盒	25T
说明书	1份

保存：-20℃，有效期一年。

• miRNA第一链cDNA的加入量不要超过Real time PCR体积10%。
  
• 对于特殊的检测体系，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(稀释10倍或者100倍)。
  
• 2×miRNA qPCR Mix中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

一、miRNA cDNA第一链合成
请参见miRNA cDNA第一链合成试剂盒产品使用说明书。

二、miRNA荧光定量检测

• 室温融化2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μm)。
  
• 使用时请将2×miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
  
• 按照下表组分配制荧光定量PCR反应体系：
  

  成分	用量
  2×miRNA qPCR Mix	25μL
  Forward Primer(自备)	1μL
  Reverse Primer	1μL
  miRNA第一链cDNA	xμl
  RNase-Free Water	至50μL

  
  
• 建议反应程序设置如下：
  

  循环	温度	时间
  1×	95℃	10min
  40～45×	95℃	15s
  	60℃	1min
  溶解曲线分析	根据PCR仪要求设定

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