产品货号：
BTN131042
中文名称：
miRNA荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名称：
miRNA SYBR qRT-PCR Kit
产品规格：
25T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒采用E.coli polyA聚合酶对miRNA加尾，然后用特异引物进行逆转录，最后用荧光定量PCR试剂盒进行定量检测。
- 两步法（加尾-逆转录、染料法qPCR），一步完成加尾-逆转录，然后检测多个miRNA靶分子。一次加尾-逆转录反应得到的cDNA可以做上百次PCR。
- 直接用总RNA为模板，不需要专门纯化miRNA，简单快捷。
- 检测灵敏度可以达到几百个拷贝/反应。
- 能区分有2～3个碱基不同的miRNA。
- 既可以定性，也可以定量。定量时线性范围至少有5个数量级，但需要自备标准品。
- 既可以用总RNA为模板，也可以用总miRNA为模板。
- 用户需要自备miRNA专一性的一条PCR上游引物。
| 组分 | 规格 |
| 加尾和逆转录Mix(含dNTP和ATP) | 150μL |
| miRNA-polyA RT引物干粉 | 1支 |
| E.coli polyA聚合酶和M-MLV逆转录酶混合液 | 40μL |
| miRNA PCR通用下游引物干粉 | 1支 |
| 2×SYBR PCR MasterMix | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒足够25次20μL体系的加尾和逆转录反应，100次20μL体系的染料法qPCR。
产品组分的两个引物用前需要加入30μL的超纯水充分溶解混匀后才可使用。
总RNA、miRNA专一性上游引物（5pmol/μL in水中）
一、设计、合成和分析自备的miRNA专一性上游引物
- 本试剂盒需要用户自行设计一条miRNA靶分子专一性的上游引物跟试剂盒提供的通用引物共同使用，用超纯水稀释到5pmol/μL待用。
- miRNA专一性上游引物的Tm值决定后续PCR的复性温度，非常重要，故必须准确。可以通过网上的在线分析软件（如oligoanalyzer）计算Tm，但最好实验测定，做法是将100pmol miRNA专一性上游引物和等量的互补引物（不是下游引物）在20μL的本试剂盒提供的2×SYBR PCR MasterMix反应体系中混合（参考第9步，只是不加模板，其他成分都加），直接进行溶解曲线分析，测出在本试剂盒提供的反应体系中的Tm值。当软件计算的Tm值和实验测试的Tm值有差异时，以后者为准。
- miRNA专一性上游引物最好在3端比miRNA短几个碱基。
- 可以选择一个所研究物种的5.8S rRNA作为内参，设计一条5.8S rRNA专一性的引物，同时做平行实验。
二、准备总RNA
- 用自选方法和试剂纯化总RNA，测定其浓度，最后用超纯水将其稀释到100ng/μL。总RNA样品中残留的DNA污染由于并没有下游通用引物（miRNA-polyA RT引物）的结合位点，所以一般不会干扰基于本方法的miRNA PCR检测。
三、加尾及逆转录反应
- 按下表设置RNA加尾和逆转录反应，以1个样品为例：
成分 用量 自备的总RNA(100ng/μL) 2.0μL 加尾和逆转录Buffer(含dNTP和ATP) 5.5μL miRNA-polyA RT引物 1.0μL E.coli polyA聚合酶和M-MLV逆转录酶混合液 1.5μL 合计 10μL - 37℃保温1小时。
- 加入190μL超纯水使得总体积为200μL（稀释20倍），此样品将作为cDNA模板用于PCR。未用完的cDNA 20倍稀释样品可以放-20℃至少两年以上。
四、染料法qPCR
- 按下表设置染料法qPCR反应，最好每个反应设置3个重复：
成分 用量 2×SYBR PCR MasterMix 10μL 自备Forward Primer(5pmol/μL) 1μL miRNA PCR通用下游引物(5pmol/μL) 1μL 第8步所得miRNA cDNA 20倍稀释液 1μL 超纯水 7μL - 建议反应程序设置如下：
循环 温度 时间 PCR循环
(45次)95℃ 15秒 （miRNA特异引物Tm-5）℃ 15秒 72℃ 20秒 溶解曲线分析 根据PCR仪要求设定 - 分析溶解曲线分析所得Tm（在70～80℃之间一般表示扩增是特异的），分析Ct值，分析标准曲线的斜率和R2（如果用阳性对照做了标准曲线反应的话）。
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